אבחון מולקולרי, טכנולוגיה ועיקרון PCR נפוץ

PCR, היא תגובת שרשרת הפולימראז, המתייחסת להוספת dNTP, Mg2+, גורמי התארכות וגורמי שיפור הגברה למערכת תחת קטליזה של DNA פולימראז, תוך שימוש ב-DNA האב כתבנית ובפריימרים ספציפיים כנקודת המוצא של הארכה, באמצעות השלבים של דנטורציה, חישול, הארכה וכו', תהליך השכפול ה-DNA של גדיל הבת במבחנה המשלים ל-DNA של תבנית גדיל האב יכול להגביר במהירות ובאופן ספציפי כל DNA מטרה במבחנה.

1. התחלה חמה PCR

זמן ההתחלה של ההגברה ב-PCR קונבנציונלי הוא לא להכניס את מכונת ה-PCR למכונת ה-PCR, ואז התוכנית מתחילה להגביר.כאשר תצורת המערכת הושלמה, ההגברה מתחילה, מה שעלול לגרום להגברה לא ספציפית, ו-PCR עם הפעלה חמה יכול לפתור בעיה זו.

מהו PCR של התחלה חמה?לאחר הכנת מערכת התגובה, משתחרר משנה האנזים בטמפרטורה גבוהה (בדרך כלל גבוהה מ-90 מעלות צלזיוס) בשלב החימום הראשוני של התגובה או שלב ה"התחלה החמה", כך שה-DNA פולימראז מופעל.זמן ההפעלה והטמפרטורה המדויקים תלויים באופי הפולימראז של ה-DNA ובמתקן ההפעלה החמה.שיטה זו משתמשת בעיקר במונדיפים כגון נוגדנים, ליגני זיקה או חומרים כימיים כדי לעכב את פעילות ה-DNA פולימראז.מכיוון שפעילות ה-DNA פולימראז מעוכבת בטמפרטורת החדר, טכנולוגיית התנעה חמה מספקת נוחות רבה להכנת מערכות תגובת PCR מרובות בטמפרטורת החדר מבלי להקריב את הספציפיות של תגובות PCR.

2. RT-PCR

RT-PCR (Reverse Transcription PCR) היא טכניקה ניסיונית לשעתוק הפוך מ-mRNA ל-cDNA ושימוש בו כתבנית להגברה.ההליך הניסיוני הוא לחלץ תחילה RNA מלא ברקמות או תאים, להשתמש ב-Oligo (dT) בתור פריימר, להשתמש ב-reverse transcriptase כדי לסנתז cDNA, ולאחר מכן להשתמש ב-cDNA כתבנית להגברת PCR כדי להשיג את גן המטרה או לזהות ביטוי גנים.

3. PCR כמותי פלואורסצנטי

PCR כמותי פלואורסצנטי (PCR כמותי בזמן אמת,RT-qPCR) מתייחס לשיטת הוספת קבוצות פלואורסצנטיות למערכת התגובה PCR, תוך שימוש בהצטברות של אותות ניאון כדי לנטר את כל תהליך ה-PCR בזמן אמת, ולבסוף שימוש בעקומה הסטנדרטית לניתוח כמותי של התבנית.שיטות ה-qPCR הנפוצות כוללות את SYBR Green I ו-TaqMan.

4. PCR מקונן

Nested PCR מתייחס לשימוש בשתי קבוצות של פריימרים של PCR עבור שני סבבים של הגברה של PCR, ותוצר ההגברה של הסבב השני הוא קטע גן המטרה.

אם אי התאמה של זוג הפריימרים הראשון (פריימרים חיצוניים) גורמת להגברת מוצר לא ספציפי, האפשרות שאותו אזור לא ספציפי יזוהה על ידי זוג הפריימרים השני וימשיך להגביר היא קטנה מאוד, ולכן הגברה על ידי זוג הפריימרים השני, הספציפיות של PCR שופרה.יתרון אחד בביצוע שני סבבים של PCR הוא שהוא עוזר להגביר מספיק מוצר מ-DNA מתחיל מוגבל.

5. Touchdown PCR

Touchdown PCR היא שיטה לשיפור הספציפיות של תגובת PCR על ידי התאמת פרמטרי מחזור PCR.

ב- Touchdown PCR, טמפרטורת החישול עבור המחזורים הראשונים מוגדרת כמה מעלות מעל טמפרטורת החישול המקסימלית (Tm) של הפריימרים.טמפרטורת חישול גבוהה יותר יכולה למעשה להפחית הגברה לא ספציפית, אך יחד עם זאת, טמפרטורת חישול גבוהה יותר תחמיר את ההפרדה של פריימרים ורצפי יעד, וכתוצאה מכך תפוקת PCR מופחתת.לכן, במחזורים הראשונים, טמפרטורת החישול מוגדרת בדרך כלל לרדת ב-1°C למחזור כדי להגדיל את התוכן של גן המטרה במערכת.כאשר טמפרטורת החישול יורדת לטמפרטורה האופטימלית, טמפרטורת החישול נשמרת למשך המחזורים הנותרים.

6. PCR ישיר

PCR ישיר מתייחס להגברה של DNA מטרה ישירות מהדגימה ללא צורך בבידוד וטיהור חומצות גרעין.

ישנם שני סוגים של PCR ישיר:

שיטה ישירה: קח כמות קטנה של דגימה והוסף אותה ישירות ל-PCR Master Mix לזיהוי PCR;

שיטת פיצוח: לאחר דגימת הדגימה, הוסף אותה ל-lysate, לייז לשחרור הגנום, קח כמות קטנה של supernatant lysed והוסף אותו ל-PCR Master Mix, בצע זיהוי PCR.גישה זו מפשטת את זרימת העבודה הניסיונית, מפחיתה את זמן השימוש, ומונעת אובדן DNA במהלך שלבי הטיהור.

7. SOE PCR

שחבור גנים על ידי חפיפה הארכת PCR (SOE PCR) משתמש בפריימרים עם קצוות משלימים כדי לגרום למוצרי PCR ליצור שרשראות חופפות, כך שבתגובת ההגברה שלאחר מכן, דרך הארכת השרשראות החופפות, מקורות שונים של טכניקת A שבהן חופפים פרגמנטים מוגברים. ומחוברים יחדיו.לטכנולוגיה זו יש כיום שני כיווני יישום עיקריים: בניית גנים של היתוך;מוטציה מכוונת אתרים גנים.

8. IPCR

הפוך PCR (IPCR) משתמש בפריימרים משלימים הפוכים כדי להגביר שברי DNA שאינם שני הפריימרים, ומגביר רצפים לא ידועים משני הצדדים של שבר DNA ידוע.

IPCR תוכנן במקור כדי לקבוע את הרצף של אזורים לא ידועים סמוכים, והוא משמש בעיקר לחקר רצפי פרומטור גנים;סידורים כרומוזומליים אונקוגניים, כגון היתוך גנים, טרנסלוקציה וטרנספוזיציה;ואינטגרציה של גנים ויראליים, נמצאים גם בשימוש נפוץ כיום. למוטגנזה מכוונת-אתר, העתק פלסמיד עם המוטציה הרצויה.

9. dPCR

PCR דיגיטלי (dPCR) היא טכניקה לכימות מוחלטת של מולקולות חומצת גרעין.

ישנן כיום שלוש שיטות לכימות מולקולות חומצת גרעין.פוטומטריה מבוססת על ספיגת מולקולות חומצת גרעין;PCR כמותי פלואורסצנטי בזמן אמת (Real Time PCR) מבוסס על ערך Ct, וערך Ct מתייחס למספר המחזור המתאים לערך הקרינה שניתן לזהות;דיגיטלי PCR היא הטכנולוגיה הכמותית העדכנית ביותר המבוססת על שיטת PCR חד מולקולה לספירת כימות חומצות גרעין היא שיטה כמותית מוחלטת.