שימוש ואמצעי זהירות של שפופרת צנטריפוגה אולטרה סינון
1) בחר צינור אולטרה סינון מתאים.שימו לב שממברנות UF שונות ברמת הסבילות שלהן לכימיקלים שונים.בדרך כלל, ניתן לבחור צינורות סינון אולטרה עם ניתוק משקל מולקולרי של 10 kDa עם ניתוק משקל מולקולרי שלא צריך להיות גדול מ-1/3 מהמשקל המולקולרי של החלבון המעניין, כגון 35 kDa.אם המשקל המולקולרי של החלבון המעניין הוא בסביבות 10 kd, ניתן להשתמש בצינור אולטרה סינון עם גזירה של משקל מולקולרי של 3 KD.
(2) סינון האולטרה, שנקנה טרי, יבש, עם מים טהורים הוסיפו לפני השימוש ומים עברו לחלוטין דרך הממברנה, אמבט הקרח או המקרר מקוררים מראש למשך מספר דקות.לאחר מכן שופכים את המים, כלומר את נוזל החלבון, וכמה מוסיפים, מה שלא יותר מהקו הלבן בראש הצינור.הפעולה קלה, ויש לקרר את צינור האולטרה סינון על קרח לפני הוספת תמיסת החלבון.
3) גם המסה וגם מרכז הכובד היו אמורים להגיע לאיזון.שימו לב שמהירות הסיבוב והתאוצה אינם מהירים במיוחד, אחרת פוגעים ישירות בממברנת האולטרה-פילטרציה.הוחל בסינון אולטרה צנטריפוגלי (צנטריפוגה מקורר מראש ל-4 מעלות).לאחר שהסל"ד של צנטריפוגות שונות הומר ל-g, זה היה שונה.תאוצת הצנטריפוגה הותאמה למינימום, תוך הפחתת הלחץ על הממברנה.שימו לב, הקפידו לעזוב את הצנטריפוגה לאחר שהצנטריפוגה הגיעה למהירות היעד שלה, או אם יש לכם בעיה, לא תוכלו לטפל בה בפעם הראשונה.כיוון הממברנה לציר מותאם בהתאם להוראות (מקרה צנטריפוגה זוויתי הוא ממברנה לציר מאונך).בשימוש מעשי, מהירות הסיבוב הכללית נמוכה מזו שבהוראות, כך שניתן להאריך את חיי הצינור הצנטריפוגה.
3) גם המסה וגם מרכז הכובד היו אמורים להגיע לאיזון.שימו לב שמהירות הסיבוב והתאוצה אינם מהירים במיוחד, אחרת פוגעים ישירות בממברנת האולטרה-פילטרציה.הוחל בסינון אולטרה צנטריפוגלי (צנטריפוגה מקורר מראש ל-4 מעלות).לאחר שהסל"ד של צנטריפוגות שונות הומר ל-g, זה היה שונה.תאוצת הצנטריפוגה הותאמה למינימום, תוך הפחתת הלחץ על הממברנה.שימו לב, הקפידו לעזוב את הצנטריפוגה לאחר שהצנטריפוגה הגיעה למהירות היעד שלה, או אם יש לכם בעיה, לא תוכלו לטפל בה בפעם הראשונה.כיוון הממברנה לציר מותאם בהתאם להוראות (מקרה צנטריפוגה זוויתי הוא ממברנה לציר מאונך).בשימוש מעשי, מהירות הסיבוב הכללית נמוכה מזו שבהוראות, כך שניתן להאריך את חיי הצינור הצנטריפוגה.
(4) כאשר מרוכז ל-1 מ"ל הנותרים, קח 50 ul של תמיסת חיץ, הוסף 10 ul של זרימה ובדוק אם יש צבע כחול, כדי לשפוט האם חסר חלבון בצינור האולטרה סינון.אם הצינורית דולפת, שפכו מחדש את השכבה העליונה וזרמו אותה לתוך צינור חדש כדי להתחיל סינון אולטרה.כדי לקבוע במדויק אם פספסו שפופרות, צנטריפוגה במשך 10 דקות עם 5 מ"ג מ"ל של BSA לפני הזרימה, הפעלה על דבק חלבון או בדיקת ברדפורד גולמית, והמשיכו על ידי הוספת תמיסת החלבון המרוכזת שנותרה (שפועלת על קרח ומונעת מחלבונים להתחמם) עד כל התרכיז התווסף.היזהר במהלך הצנטריפוגה אם מתרחשת משקעים של חלבונים, מה שמוביל לסגירת הצינור.אם מתרחשים משקעים, קבע אם הסיבה הספציפית למשקעים היא ריכוז חלבון מופרז או חיץ לא מתאים;את הראשון ניתן לפתור על ידי סינון אולטרה של מספר צינורות אולטרה סינון בו זמנית, הפחתת הריכוז, והאחרון על ידי החלפת תמיסות חיץ שונות עד שלא מתרחשת משקעים של החלבון.
(4) כאשר מרוכז ל-1 מ"ל הנותרים, קח 50 ul של תמיסת חיץ, הוסף 10 ul של זרימה ובדוק אם יש צבע כחול, כדי לשפוט האם חסר חלבון בצינור האולטרה סינון.אם הצינורית דולפת, שפכו מחדש את השכבה העליונה וזרמו אותה לתוך צינור חדש כדי להתחיל סינון אולטרה.כדי לקבוע במדויק אם פספסו שפופרות, צנטריפוגה במשך 10 דקות עם 5 מ"ג מ"ל של BSA לפני הזרימה, הפעלה על דבק חלבון או בדיקת ברדפורד גולמית, והמשיכו על ידי הוספת תמיסת החלבון המרוכזת שנותרה (שפועלת על קרח ומונעת מחלבונים להתחמם) עד כל התרכיז התווסף.היזהר במהלך הצנטריפוגה אם מתרחשת משקעים של חלבונים, מה שמוביל לסגירת הצינור.אם מתרחשים משקעים, קבע אם הסיבה הספציפית למשקעים היא ריכוז חלבון מופרז או חיץ לא מתאים;את הראשון ניתן לפתור על ידי סינון אולטרה של מספר צינורות אולטרה סינון בו זמנית, הפחתת הריכוז, והאחרון על ידי החלפת תמיסות חיץ שונות עד שלא מתרחשת משקעים של החלבון.
(5) הצעדים הראשונים משמשים לריכוז החלבון, ואם יש להחליף את המאגר, הוסף בעדינות חיץ חדש (סינון אולטרה-פילטרני דרך ממברנת אולטרה-סינון של 0.22um) לכ-1 מ"ל של חלבון הכולל, ורכז מחדש לכ-1 מ"ל למשך שלושה פעמים רצופות, כאשר הנפח הסופי המרוכז הסופי תלוי בריכוז החלבון הרצוי, בדרך כלל לא יותר מ-500 ul, אך גם עד 200 ul.השג 1000 × או יותר בשלוש הזדמנויות, בעצם באותה מידה של שינוי חיץ, כפי שחושב על ידי העשרה של לפחות 10 × בערך בכל פעם.
(5) הצעדים הראשונים משמשים לריכוז החלבון, ואם יש להחליף את המאגר, הוסף בעדינות חיץ חדש (סינון אולטרה-פילטרני דרך ממברנת אולטרה-סינון של 0.22um) לכ-1 מ"ל של חלבון הכולל, ורכז מחדש לכ-1 מ"ל למשך שלושה פעמים רצופות, כאשר הנפח הסופי המרוכז הסופי תלוי בריכוז החלבון הרצוי, בדרך כלל לא יותר מ-500 ul, אך גם עד 200 ul.השג 1000 × או יותר בשלוש הזדמנויות, בעצם באותה מידה של שינוי חיץ, כפי שחושב על ידי העשרה של לפחות 10 × בערך בכל פעם.
זמן פרסום: נובמבר-09-2022